京都久坂玄瑞提出“大和御幸(大和皇家视察)、8月13日，在亲长州派公卿三位实美等大臣的尽力下，朝廷下达了御亲政“熙夷御亲征”的建白书。但与此同时，幕府知道了长州藩擅自主持的激进熙夷派的举动，于是与会津藩、萨摩藩、中川宫朝彦亲王等公武合体派的公卿一起动员「八月十八日政变」，长州势力被朝廷一扫而空，长州藩也被解除了宫门警卫的职责，孝明天皇也发表了“支持熙熙攘攘，反对倒闭”的意见。而久坂玄瑞暂时以京都盘政务座的身份留在京都，并计划回复失地。在此期间，三条实美、真木、泉、来岛又兵卫等主张向京都进军的“进发论”，但久坂玄瑞、桂小五郎却阻止了这一举动。
第二年4月，九坂玄瑞想乘坐萨摩藩的岛津久光、福井藩的松平春岳、宇和岛藩的伊达宗城离开京都，让长州藩的世子毛利定广上京。
但次年元治元年(1864年)6月5日(以下时间均为旧历)，池田屋事件的悲剧传到中国，导致藩内攻击京都的意见开始沸腾。在无法控制过热的藩内舆论下，九坂玄瑞不得不来到岛上，兵卫、真木、泉带领团队东上参军。益田亲施、坂玄瑞等人在山崎天王山、宝山，国司亲相、来岛兵卫等人在峨龙寺，福原阵长期在长州屋铺兵、布兵。24日，他起草了《叹愿书》，引起了诸侯志士和朝廷许多公卿的同情。然而，7月12日，萨摩藩士兵抵达京都后，情况突然发生了变化。
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最后，7月18日，久坂玄瑞与20多名主要干部在男山八旗宫(石清水八旗神社)本阵召开最后一次会议。九坂玄瑞坚持不应违反朝廷命令率兵进发，但来岛的兵卫斥责道：“进军有什么可以犹豫的？久坂玄瑞回答说：“这件事本来是为了洗刷君主无实罪，应该多次重申我们的请求。一开始我们不想战斗。而且世子君马上就要来了，等他决定要不要进攻比较合适。现在，如果我们的军队进攻，不仅没有援军，而且我们的军队也没有做好充分的准备。为了赢，我们最好等到时机成熟。来岛的兵卫又骂道：“卑怯者”、“我知道你这个医生男孩会拒绝的。如果你犹豫要不要吝惜自己的生命，就留在这里。其他人帮我一臂之力，消灭恶人！然后离开座位。真木和泉，最年长的参谋，也说“我同意来岛君的意见”，决定进攻。久坂玄瑞一言不发地离开座位，回到天王山本阵。
各藩增援京都的兵力在2万到3万之间，而长州藩只有不到2000人，所以这对长州藩来说是一个很大的挑战。
7月19日，来岛的兵卫率先领兵进攻蛤御门。结果，来岛的兵卫率领部队与会津藩的士兵交火时，被萨摩藩的士兵攻击。来岛的兵卫被西乡隆盛指挥的部队狙击伤害，然后自杀。来岛队的士兵突然失败了。
虽然不情愿，但九坂玄瑞仍然是真木和泉等人支持岛上和士兵，但由于迟到了一步，九坂玄瑞想再次通过鹰司辅熙向朝廷发出申请，所以他带领部门进攻鹰司府附近的酒吧御门，无法击败守卫大门的越前藩军队，于是带领部队翻墙进入鹰司辅熙大厦，九坂玄瑞亲自要求鹰司辅熙再次帮助自己提交叹息（申请），但被拒绝了，然后鹰司辅熙从九坂玄瑞手中挣脱逃跑。随后，越前藩的士兵从会津藩手中借来了大炮轰击，长州藩的士兵开始四下溃散。随后，越前藩的士兵从会津藩手中借来了大炮轰击，长州藩的士兵开始崩溃。鹰司辅熙邸起火后，久坂玄瑞劝阻想和他一起自杀的进入江九一。“无论如何，我们都应该逃离包围，向世子君报告，让他不要靠近京都。但入江九一刚从鹰司辅熙邸逃出来，就被越前藩的士兵发现，一枪戳在脸上死了。
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长坂玄瑞和寺岛忠三郎一起互刺自杀，最后留在鹰司邸。享年25岁。
九坂玄瑞死后，发生了一场大火，尸体最终没有得到确认。入江九一与鹰司大厦附近的其他八名长州藩藩一起，在松平春岳的许可下，被埋葬在京都福井藩的墓葬上山寺。据说九坂玄瑞也在其中。
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九坂玄瑞和妻子文之间没有孩子。因此，他的连襟小田村伊之助将他和前妻寿(文的姐姐)之间的次子二郎继承为养子，玄瑞死后，二郎继承了九坂家。然而，玄瑞在京都和艺妓之间有一个遗产。明治维新后，孩子被承认，被命名为秀次郎，继承了九坂家。后来在大仓组台湾基隆支社工作。久坂玄瑞的画像是以秀次郎为原型描绘的。
此时，小田村伊之助改名为“素彦”，而“二郎”则将“道明”命名为“道明”，并返回并继承了“素彦”。后来，道明在台湾芝山岩事件中被杀害「六氏先生」一员被祭祀。生母去世后，他的父亲苏彦和文再婚了。
久坂玄瑞有孩子吗？谁是久坂玄瑞的孩子？